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      學術報告

      2023-04-23
      有濟說 | 放射性同位素示蹤技術在非臨床藥代動力學研究中的應用
      來源: 作者: 瀏覽次數:451

           新藥研發過程中,了解候選藥物在用于毒理和藥效評價中的動物種屬和人體體內的變化過程至關重要。通過藥代動力學研究,以不同的方式檢測原形藥物及其主要代謝物的濃度水平以闡明藥物在體內、體外的吸收、分布、代謝和排泄(ADME)等性質是藥物開發過程中重要的研究內容之一,也是藥物注冊過程中不可缺少的關鍵部分。傳統的檢測手段包括HPLC-UV(HPLC-紫外檢測)、HPLC-FL(HPLC-熒光檢測)、LC-MS/MS法等。放射性同位素示蹤技術以其特有的優勢,越來越多的應用到臨床前及臨床藥代動力學研究中。




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      一、放射性同位素標記方法的選擇

      使用放射性同位素示蹤技術進行ADME研究,選擇合適的放射性核素和標記位置至關重要。常用的核素有14C、3H、125I、32P、35S等。對于小分子化合物,14C3H是最常用的放射性核素,其特點主要有[1-2]:① 14C3H發出的是很安全的低能β射線,易于防護;② 使用液閃進行檢測,實驗操作及結果檢測十分方便。


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      在藥代動力學研究中,基于14C特有的性質,已成為最常用的放射性核素;與14C放射性核素相比,3H標記由于其標記物容易與環境中的1H原子發生交換,導致其穩定性較差使其應用受到了一定的限制;125I主要用于蛋白/多肽類藥物研究;32P、35S等較少使用。


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      標記位置的選擇,應該遠離化學活性位點和代謝易受攻擊位置,因為一旦這些不穩定基團脫離母體化合物,就失去了對母體藥物及主要代謝物的示蹤能力。對于14C一般應首先考慮對分子結構中的芳香環或脂環上的C原子進行標記[3-4],盡可能避免在羧基、羥基、巰基、氨基等活性部位進行標記。對于代謝物攻擊位點正好在藥物的活性中心時,采取雙標記技術的放射性示蹤劑是必要的,最好選用不同能量或發射不同類型射線的核素[5],例如14C/3H、14C/125I等。

      另外,標記的純度也是影響研究結果的重要因素,一般通過放化純度和比活度來評價。對于14C3H標記化合物的放化純度與化學純度一般均應≥95%,并不含有>1%的單一雜質[2]。






      二、放射性同位素標記藥代動力學研究的應用范圍

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      體外藥代動力學研究


      體外代謝研究:通常采用肝微粒體或S9、肝細胞進行體外孵育,通過放射性檢測和LC/MS/MS對樣品進行色譜分析,來追蹤和鑒定代謝物,獲得全面的人和動物(如小鼠、大鼠、兔、犬、猴等)體外代謝產物譜、顯示種屬差異、幫助毒理及藥代研究動物種屬的選擇。

      體外腸吸收研究:對于口服藥物的研發,藥物的腸道滲透性是影響藥物生物利用度的關鍵因素,采用Caco-2細胞模型,結合放射性同位素示蹤技術已廣泛用于評價藥物腸道滲透能力[5-7]。與傳統的LC-MS/MS方法相比,同位素探針藥物的測定操作簡單,耗時短并且檢測限低,并被FDA推薦應用?;诒緦嶒炇业难芯拷涷灪椭笇г瓌t[7]中的要求,不同滲透性類別的同位素標記對照藥總結如下。


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      體外基于轉運體的DDI研究:藥物轉運蛋白直接參與藥物的吸收、分布、排泄等藥動學行為[8],基于轉運體的DDI研究是非臨床藥代動力學研究中重要的環節。采用穩定表達轉運蛋白的細胞系結合放射性同位素示蹤技術,因其操作簡單、快速、檢測限低等優勢,在藥物基于轉運體的DDI研究中得到越來越廣泛的應用?;诒緦嶒炇业慕涷灱拔?/span>[5]中的報道,常用的轉運蛋白和相應的同位素標記探針底物總結如下。


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      體內藥代動力學研究


      藥物及其代謝物總體的系統暴露和生物利用度研究:動物給藥后,通過檢測全血或血漿中總放射性,研究藥物(代謝物)的系統暴露和生物利用度。


      物料平衡、清除機制及排除途徑研究:分析和鑒定從血漿、尿、膽汁和糞便收集到的放射性物質,結合色譜與質譜技術,分析、鑒定原形藥物和代謝產物。


      組織分布研究:通過氧化燃燒分析或定量全身放射自顯影技術(QWBA),研究藥物及其代謝物在體內的分布情況。


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      三、放射性同位素標記藥代動力學研究中常見的問題和解決方案


      問題1:給藥劑量計算及給藥過程有哪些注意點?

      1)給藥劑量除按常規劑量水平(mg/kg)表示外,還需提供放射性劑量(μCi/kg),每只動物的實際給藥量按照μCi/動物或dpm/動物計算,一般臨床前研究動物給藥劑量設置為100 μCi/動物;

      2)一般采用稱重法確定實際給藥量,即注射器給藥前后的重量差。

      問題2:樣品采集及終點確定?

      1)樣品類型:除了常規的全血、血漿、尿、膽汁、糞便、組織等樣本外,注意必要時對籠具清洗液進行收集。

      2)采集時間及采集終點的要求:血液樣本的收集時間點可根據藥物的藥代動力學參數決定;排泄物一般采樣7~10天(對于長半衰期的藥物,應適當延長采樣時間),或采樣至排出的放射性量超過給藥量的90%或連續2天的排出放射性量小于放射性給藥劑量的1%

      3)回收率:進行小動物(如小鼠、大鼠等)物質平衡試驗時,如總放射性回收率<90%,應測定尸體殘留總放射量。

      問題3:樣品處理與分析與傳統方法的區別?

      1)與傳統的LC-MS/MS法相比,在樣品處理與分析過程應密切關注放射性的回收率,一般總回收率應≥85%;

      2)使用HPLC在線或離線放射性檢測儀幫助鑒定工作中對代謝產物的監測。


      總結

      放射性同位素標記示蹤技術在藥物研發過程中,特別是在藥代動力學研究中得到了廣泛的應用?;谄涮赜械膬瀯?,與傳統的生物分析技術互為補充,在藥物動力學表征、組織分布、代謝/排泄機制和物質平衡中發揮了積極的作用。


      有濟醫藥已成功取得輻射安全許可證,可以承接3H、14C、125I、99mTc等放射核素標記物的非臨床與臨床相關研究。目前已經承接和開展多項非臨床及臨床研究項目,放射核素涵蓋3H、14C、125I,藥物類型包括小分子及多肽類藥物,研究類型涵蓋體內及體外(含腸道吸收及轉運體)等研究。



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      參考文獻:

      [1] Philipp Uhl, Gert Fricker, Uwe Haberkorn, Walter Mier. Radionuclides in drug development [J]. Drug Discov Today, 2015 Feb;20(2):198-208.
      [2] 《藥物非臨床藥代動力學研究技術指導原則》(2014年5月)
      [3] Huskey S E, Zhu C Q, Fredenhagen A, et al. KAE609 (Cipargamin), a new spiroindolone agent for the treatment of malaria: Evaluation of the absorption, distribution, metabolism, and excretion of a single oral 300-mg dose of [14C]KAE609 in healthy male subjects [J]. Drug Metab Dispos, 2016, 44(5): 672-682
      [4] Chen Y, Skende E, Lin J, et al. Absorption, distribution, metabolism, and excretion of [(14)C]-dasotraline in humans [J]. Pharmacol Res Perspect, 2017, 5(1): e00281.
      [5] Huang S M, Temple R, Throckmorton D, et al. Drug interaction studies: study design, data analysis, and implications for dosing and labeling [J]. Clin Pharmacol Ther, 2007, 81(2): 298-304.
      [6] 魏敏吉. 創新藥物藥代動力學研究與評價 [M]. 北京: 北京大學醫學出版社. 2008.
      [7] 《人體生物等效性試驗豁免指導原則》,(2016年5月)
      [8] FDA Guidance for Industry: In Vitro Drug Interaction Studies —Cytochrome P450 Enzyme- and Transporter-Mediated Drug Interactions, January 2020.
      [9] FDA Guidance for industry developing medical imaging drug and biological products part 1: conducting safety assessments[S].MD:FDA,2004.
      [10] U.S. Food and Drug Administration. Guidance for industry developing medical imaging drug and biological products part 2: clinical indications [S].MD:FDA,2004.
      [11] U.S. Food and Drug Administration. Guidance for industry developing medical imaging drug and biological products part 2: design, analysis, and interpretation of clinical studies [S].MD:FDA,2004.



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