一、免疫原性基本概述
免疫原性（Immunogenicity）是指藥物和/或其代謝物誘發對自身或相關蛋白的免疫應答或免疫相關事件的能力。當治療類蛋白產品作為藥物時，會被機體識別為外來物質而產生免疫應答，但對于治療性蛋白的不必要或非預期的免疫應答則會給藥物的安全和療效帶來風險，甚至會因為抗藥抗體和內源蛋白交叉給病人帶來生命危險。
機體的免疫反應通常包括兩種類型，一種是固有免疫，主要包括皮膚、粘膜及體液中的殺菌物質所構成的第一道和第二道防線。另一種為適應性免疫，又稱特異性免疫，也是免疫原性研究主要討論和監測的范疇。適應性免疫主要包括體液免疫（通過B細胞介導產生特定ADA）和細胞免疫（通過T細胞介導釋放細胞因子）。對于大多數藥物，不良免疫反應通常由體液免疫介導，但對于細胞基因治療類的產品，除體液免疫外，還需要更多的關注細胞免疫。
免疫原性研究中檢測的抗體通常包括:(1)抗藥抗體(Anti-Drug Antibody,ADA):通常特指抗藥結合抗體;(2)中和抗體(Neutralizing Antibody,NAb):是指能夠干擾藥物與其靶點相互作用的抗藥抗體。中和抗體往往能夠極大的降低或中和藥物的藥效作用，所以必要情況下還需要開展中和活性試驗評估抗藥抗體對藥物的中和能力/程度。當然，除了疫苗類產品以外，中和抗體通常都是非預期產生的抗體。
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免疫原性產生的影響因素
1.1內源性因素
藥物的氨基酸序列：相比于人源化氨基酸序列，非人源氨基酸序列的藥物更易產生ADA。 結構修飾：為了增強療效或改變半衰期，人為對序列進行結構修飾（包括唾液酸修飾、氨基酸位點突變、去海藻糖、融合蛋白、PEG化等）。這些結構變化均是引起免疫原性發生的風險因素。 1.2外源性因素 產品工藝：多聚體、雜質、去末端氨基酸和降解。如藥物產品在制備過程中引入了較高水平的雜質，包括多聚體、降解產物、變性蛋白等，則ADA的發生率會相對高一些。 制劑：輔料、包裝材料等。 治療相關因素：如給藥途徑、頻率等。相比于靜脈、口服給藥，通常采用皮內、吸入給藥的途徑更易產生ADA；連續多次給藥相比于單次給藥ADA的發生率通常更高些。 患者相關因素：自身免疫性疾病患者的免疫系統通常處于激活狀態，一般更易產生ADA，相反如患者的免疫系統處于抑制狀態，則不易產生ADA。
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免疫原性研究的必要性
免疫原性的產生影響廣泛，從無臨床意義抗藥抗體的暫時出現，到能夠改變藥物藥效或產生副作用，甚至嚴重到危及生命。主要影響以下幾方面：
安全性：ADA的產生會導致機體發生藥物過敏反應；對于免疫調節類藥物，可能會導致免疫細胞過度活化，促炎性因子快速釋放而引發細胞因子風暴；抗原抗體復合物的形成也會帶來安全風險。 藥效學：中和抗體的產生可能降低或中和藥物療效，改變藥物生物分布。 藥動學：改變組織分布，改變清除率及體內暴露量，干擾血藥濃度測定。
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免疫原性的研究內容
免疫原性研究貫穿藥物研發、非臨床研究、臨床研究、上市后藥物監測的整個生命周期，是藥物研發的重要組成部分。在免疫原性全程式研究中，應始終關注抗藥抗體生成與藥代/藥效動力學、療效以及安全性之間的相關性。
治療性蛋白藥物通常具有種屬差異，基于動物免疫原性研究結果預測人體免疫原性具有局限性。但是，在非臨床研究中進行免疫原性評價仍然具有一定意義。免疫原性相關反應可導致非臨床研究結果復雜化并難以解釋，免疫原性數據有助于安全性數據的整體解讀和分析。而臨床試驗中對于抗藥抗體的檢測更是成為了藥監局的監管要求。
評價藥物通常包括治療性蛋白、多肽及其衍生物、ADC、細胞產品、基因治療藥物、病毒載體類藥物等。 免疫原性為定性研究，主要聚焦在抗藥抗體的檢測和表征。通常應獲得ADA的發生率、滴度、存續時間和中和能力等數據；必要時可對抗體同種型、亞型、結合表位或與內源性蛋白的交叉反應性進行確認。 免疫調節類藥物需對動物體內毒性試驗中的相關細胞因子變化水平進行監測，并開展體外細胞因子釋放試驗。
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ADA產生的機制
ADA產生的機制主要包括兩種：T細胞依賴途徑和T細胞非依賴途徑。
T細胞依賴途徑：藥物作為抗原被抗原提呈細胞（APC）攝取內化，加工為抗原多肽片段；多肽-MHC II類分子與T細胞表面受體（TCR）識別并結合，激活T細胞；T細胞活化誘導B細胞增殖和分化為漿細胞，合成并分泌特定ADA（IgG）。此類型ADA免疫應答作用強，持續時間長。 T細胞非依賴途徑：藥物可直接作用B細胞表面受體（BCR），誘導B細胞分化漿細胞；同時樹突細胞也可將藥物提呈至B細胞，誘導B細胞分化漿細胞，合成并分泌特定ADA（IgM為主）。因為該途徑沒有T細胞輔助，產生的ADA主要為IgM型，親和力低、持續時間短、特異性差，且比T細胞依賴途徑的免疫應答作用弱。
圖1. ADA的產生機制[1]
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ADA的分類及特性
ADA即為抗體，抗體是機體免疫系統在抗原刺激下，由B淋巴細胞或記憶細胞增殖、分化成的漿細胞產生的效應免疫分子?？贵w介導體液免疫，主要分布在血清中，是可與相應抗原發生特異性結合的免疫球蛋白。
根據產生的抗體重鏈的不同，ADA通常分為以下五種類型：IgG、IgE、IgM、IgA、IgD。各個抗體類型的特點如下表所示。
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ADA的檢測方法
在ADA分析方法開發之前，應充分了解目標待測物，根據受試藥物性質及特點選擇合適的分析方法，通常包括酶聯免疫吸附測定法（ELISA）、電化學發光法（ECL）、放射免疫分析法（RIA）、表面等離子體共振檢測法（SPR）、全自動納升級免疫分析工作站Gyrolab等。其中，應用最為廣泛的方法主要包括ELISA法和ECL法。
直接ELISA：此法的優勢在于能夠增加低親和力抗體的檢測，但缺點是僅能檢測單一亞型，且具有種屬特異性。 Bridging-ELISA：此法的優勢在于能檢測各類抗體亞型，無種屬特異性，可高通量檢測，缺點是不易檢測到低親和力的抗體。目前，該法也是業內ADA檢測應用較為廣泛的方法。 ECL法：該法基于MSD平臺，優勢在于可以檢測所有亞型，無種屬特異性，同時可以檢測低親和力抗體，靈敏度和耐受性高。所以，這種方法在臨床檢測中的應用也比較廣泛。
圖2. ELISA和ECL法檢測ADA的原理示意圖
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NAb的檢測方法
NAb的檢測方法通常包括兩種，一種是基于細胞的生物學試驗(cell based Assay，CBA)，一種是非細胞的配體競爭性試驗(non-cell competitive ligand-binding assay，CLBA)。這兩種方法的選擇通?；谝韵聨讉€因素：①由藥物類型和藥物作用機理（MOA）決定；②方法性能（如數據的可靠性）；③藥物免疫原性的風險。目前，CBA法是被監管部門認為是衡量藥物產生中和抗體傾向的金標準。但對于拮抗型單克隆抗體通常首選CLBA（通過結合發揮作用的），受體激動劑的藥物或者ADC藥物推薦首選CBA。以下為兩種方法優劣勢的比較。
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免疫原性的相關法規
歐洲藥品監管機構（EMA）于2007年發布首版免疫原性評價的指導原則，并于2017年發布最終版本，適用的范圍包括蛋白質、多肽及衍生物等。該版本對于免疫原性分析的技術細節并未作過多規定，申辦方可根據適用目的原則選擇最優的方法來滿足監管要求。
美國FDA于2014年首次發布了免疫原性評價指導原則。2016年，為適應行業的發展及審評要求，又發布了針對ADA檢測方法開發和驗證的指導原則草案并于2019年正式生效。
國家藥品監督管理局（NMPA）于2020年08月發布了《藥物免疫原性研究技術指導原則（征求意見稿）》，并于2021年03月發布正式版本，填補了我國免疫原性研究相關技術規范的空白。該版指導原則中對于免疫原性的整體評估策略與EMA、FDA指導原則基本一致，不同之處在于NMPA正式版對非臨床和臨床免疫原性分析方法的差別作了較為詳細的區分。
此外，相關組織協會（如歐洲生物分析論壇）也會定期召開行業會議，發布免疫原性方面的白皮書，這些白皮書針對免疫原性的熱點問題也會給予諸多指導。
二、免疫原性評價策略
圖3.免疫原性多層級策略示意圖
結語
治療性蛋白藥物是醫藥產業的焦點，而免疫原性分析在生物療法發展中越來越受到關注。為了提高藥物研發的成功率，研究者通常會將免疫原性的評估前移，從藥物設計階段就通過各種技術手段預測或降低藥物的免疫原性。因此，科學合理的免疫原性分析和評估也有助于藥物篩選、非臨床安全性評價、臨床試驗等的順利推進。相信隨著免疫原性評價技術的不斷更新和完善，勢必會更加全面、深入地推動藥物研發進程。
[2]藥物免疫原性研究技術指導原則，國家食品藥品監督管理總局（NMPA），2021.03。
[3]FDA: Guidance for Industry Immunogenicity Assessment for Therapeutic Protein Products, 2014.08.
[4]FDA: Immunogenicity Testing of Therapeutic Protein Products Developing and Validating Assays for Anti-Drug Antibody Detection (Guidance for Industry), 2019.01.
[5]EMA: Guideline on immunogenicity assessment of therapeutic proteins.2017.
[6]USP40 1106 IMMUNOGENICITY ASSAYS—DESIGN AND VALIDATION OF IMMUNOASSAYS TO DETECT ANTI-DRUG ANTIBODIES
[7]Recommendations for Systematic Statistical Computation of Immunogenicity Cut Points. V. Devanarayan et al. AAPS, 2017, 19(5), 1487-1498.
[8]Anti?drug Antibody Validation Testing and Reporting Harmonization. Heather Myler et al. AAPS, 2022, 24(1):4.
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